输尿管支架

输尿管支架置入体内后,短时间内尿液中的蛋白、多糖等生物大分子迅速扩散到支架表面,形成生物膜,后续无机离子吸附导致钙化沉积,使其无法完全实现原有功效。

生物材料表面特性的差异,如粗糙度、疏水性等,是出现细菌黏附和钙化差异的可能因素。材料表面的微观不规则性通过充当晶体生长和细菌定植的成核位置,促进了细菌的黏附和钙化,因此对支架表面进行涂层处理是一种减少或阻止支架表面钙化及生物膜形成的优选方法。

ParyleneC为ISO10993和美国药典VI级,且通过UDP第六类塑料的认定试验包括细胞毒性、致敏作用、皮内刺激性、急性系统性毒性、植入(需要1、12和26周)和血溶性试验,获FDA批准可作为血袋的内表面涂层或心血管支架的基础涂层,经其涂敷可以提高器件表面的润滑性、生物相容性和可靠性。

为达到输尿管支架抗钙化效果,使用聚对二甲苯(paryleneC)对部分热定型处理后的输尿管支架进行涂层处理。最终得到用于体外动态模拟的测试样品,未涂层处理裸支架代号1-1、1-2、1-3;涂层处理支架代号2-1、2-2、2-3,每种支架各3个，如图1所示。

图1 涂层前后输尿管支架 

支架表面理化性能

表面润湿性

(1) 测试方法

为评价支架表面涂层前后的润湿行为,在20℃、65%相对湿度条件下,使用水接触角测试仪,通过悬液法进行光学水接触角(WCA)的测量。支架上的水滴体积为1μL,每个试样选取5个不同的测试点进行测试,结果取平均值并计算标准差。

(2) 结果分析

WCA是评价表面亲疏水性的最常用方法,当液体滴在固体表面时,在固、液、气相交接处,由于不同固体表面微结构粗糙程度和表面自由能存在差异,在静态下,液体将在固体表面形成一定的角度,液体内部到液、气的夹角称为静态接触角,其大小由材料表面的性质决定,当0<θ<90°时,呈亲水性;当90°<θ<180°时,呈疏水性,接触角越大,钙化成核所需能量越大,晶核形成越难,钙化趋势越小;

图2 支架涂层前后表面静态接触角 

输尿管支架涂层前后表面静态接触角如图2所示。在实验误差范围内,涂层前后镍钛合金输尿管支架均表现为疏水性,未处理支架表面静态接触角分别为100.24°、102.10°、99.96°,经涂层处理后的支架表面接触角增加至125.97°、124.03°、124.60°,可见paryleneC涂层处理后支架疏水性增强。这是因为paryleneC致密分子结构决定了涂层表面摩擦系数低,同时诱起电压高,表面能低,显著提高表面疏水性,使钙化沉积很难附着在涂层表面;同时涂层是由气态的活性小分子在支架表面敷形而成,固液界面的气膜可进一步降低表面能。

抗细菌黏附性

生物膜的形成是导致支架钙化的主要促进因素之一,有研究表明支架置入人体后,2~8小时内会发生细菌黏附,24小时后会形成生物膜,加速钙化。降低细菌在支架上的黏附和生物膜的形成是抗钙化改性策略之一。

(1) 测试方法

1、细菌传代培养

用200μL的培养基溶解大肠杆菌(E.coli,ATCC25922)冻干粉,使其与培养基混合形成混悬液。吸出混悬液并接种至试管上,并将试管置于隔水式恒温培养箱内进行传代培养,重复培养至获得活性较高的Ⅲ代菌落用于后续实验。

2、工作菌液配置

为研究大肠杆菌菌株在光滑表面的黏附情况。将其置于37℃、120rmp的恒温摇床中培养后,用PBS缓冲液稀释稀释至107CFU/mL待用。

3、涂布平板计数法

将E.coli培养液至每毫升1×107个细菌。将1-1、1-2、1-3、2-1、2-2、2-3样品置于24孔板,将1mL细菌悬浮液加入孔板中,在37℃恒温培养6小时后,将孔中的菌液吸出,加入1mLPBS缓冲液清洗镍钛丝表面3次,除去未牢固黏附的细菌。之后用无菌钳子取出样品,置于含有3mLPBS缓冲液的离心管中,在无菌条件下超声处理,剥离镍钛丝表面黏附的细菌。将从表面剥离的细菌溶液按照一定的倍数进行梯度稀释至105CFU/mL,吸取100uL菌液均匀地滴在TSB琼脂培养板上,用涂布棒均匀进行涂布,直至菌液被培养板完全吸收。将TSB琼脂培养板37℃恒温培养12小时,观察TSB琼脂培养板上细菌的生长情况,统计菌落数,并用相机拍照记录。

结果分析

细菌在材料表面黏附是细菌定植,侵袭和形成生物膜的第一步。细菌的黏附过程包含黏附与增殖两个组成部分,阶段I是细菌细胞表面和材料表面之间的初始相互作用,此阶段中细菌在材料表面寻找合适的黏附点。阶段II是细菌之间的特异性和非特异性相互作用,细菌表面结构上表达的黏附素蛋白探索到合适的黏附位点后,细菌开始分泌细胞外代谢产物,微生物膜开始形成。因此,阻断细菌在材料表面寻找黏附位点,抑制细菌在材料表面黏附对防止生物膜的形成具有重要意义。

抗细菌黏附实验结果表明,与未处理支架相比,经过涂层处理后,黏附在paryleneC涂层处理支架表面的细菌在平板上的菌落数显著减少,防大肠肝菌黏附性能显著提升,如图3所示。

图3 涂层前后支架表面黏附菌落 

以上结果表明涂层处理后的试样表面paryleneC涂层处理有效改变输尿管支架表面性能,抗细菌黏附能力提升,一方面,真空气相沉积制备得到的涂层固液结合处的气膜可减少细菌吸附,另一方面结合paryleneC分子式分析,非功能性的惰性涂层改善了镍钛合金编织支架表面的润滑性能,支架表面能降低,黏附的细菌易于脱落,难以滞留于支架表面形成生物膜。